一区新文 | 天昊专利技术Accu16S细菌和AccuITS真菌绝对定量测序助力大曲发酵研究登陆《FRI》

原创上海天昊生物

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喜报！

天昊生物自主研发创新型专利技术Accu16S^®细菌和AccuITS^TM真菌绝对定量测序项目，再获SCI一区好文章！

这也是继Accu16S^®细菌绝对定量服务广受认可后，在AccuITS^TM真菌绝对定量服务项目上喜获的首篇项目文章。

近日，由中国农业大学食品科学与营养工程学院研究人员在食品科学领域的一区杂志《Food Research International》上成功发表研究论文。该研究同时利用了天昊生物Accu16S^®细菌和AccuITS^TM真菌绝对定量测序专利技术，系统探讨了不同类型大曲中微生物群落的相对和绝对丰度，分析了其与理化因子及挥发性代谢物之间的相关性。本研究还分析了大曲中的噬菌体组成及功能，为大曲发酵过程的微生物研究提供了新的见解。

英文题目：Insights into the bacterial, fungal, and phage communities and volatile profiles in different types of Daqu

中文题目：不同类型大曲中的细菌、真菌和噬菌体群落及挥发性物质研究

期刊名称：Food Research International

发表时间：2022年6月7日

影响因子：6.475 (一区)

背景简介

大曲起源于中国古代，现在是白酒和醋生产中最常用的糖化和发酵曲之一。一般来说，它是以小麦或大麦和豌豆为原料，通过配料、研磨和混合、成型、培养和熟化等生产过程。大曲归类为高温大曲(HTDQ, 60–70℃)、中温大曲(MTDQ, 50–60℃)和低温大曲(LTDQ, 40–50℃)。

已经有研究利用传统的相对定量扩增子测序技术，评估大曲微生物群相对丰度，揭示了微生物群落的多样性、微生物动力学，以及微生物的来源。然而，使用相对定量的一个缺点是，它们可能掩盖了真实丰度的主要变化，因此，仅根据相对丰度来解释微生物组数据可能是错误的。绝对微生物数量对于微生物生态学的所有领域都至关重要。

为了获得完整和深入的微生物信息，本研究利用天昊生物专利技术Accu16S^®细菌绝对定量测序和AccuITS^TM真菌绝对定量测序，通过人为加入spike-in标准品来实现微生物绝对定量，分析大曲中细菌和真菌的绝对丰度。

此外，噬菌体在食物发酵系统中的作用知之甚少，本研究还利用宏病毒组测序检测了不同类型大曲中固有噬菌体的组成、宿主和功能。

研究方法

大曲样品于2021年从中国不同酒厂收集。样品分为三类：使用大麦和豌豆制备的LTDQ（40–50℃）样品，使用小麦制备的MTDQ（50–60℃）样品，和使用小麦制备的HTDQ（60–70°C）样品。从储藏室的顶部、中部和底部收集3个平行样品，然后合并形成1个样品。将每个混合样品分成两部分；一部分在-20℃下保存，用于理化和代谢物分析，包括水分、pH、酸度、液化力、糖化力、酸性蛋白酶活性、糖、多元醇、酸和氨基酸的组成和含量，以及挥发性化合物的检测分析。另一部分在-80℃保存用于Accu16S^®细菌（V3-V4区）和AccuITS^TM真菌（ITS2区）绝对定量测序分析和宏病毒组分析。

研究结果

理化因子的比较

大曲的理化性质和酶活性是决定大曲质量的重要因素。LTDQ、MTDQ和HTDQ的平均含水量依次增高。LTDQ组的平均酸度值与MTDQ和HTDQ组相比明显更高。MTDQ的糖化能力显著高于HTDQ和LTDQ。LTDQ和MTDQ的液化能力明显强于HTDQ。较高的糖化和液化能力可以提高原料中淀粉和纤维素向葡萄糖的转化。此外，HTDQ显示出比LTDQ高得多的酸性蛋白酶活性。蛋白酶将蛋白质降解成肽和氨基酸的能力对微生物生长和风味产生来说是必不可少的。

利用¹H核磁共振光谱分析了大曲中的糖、多元醇、酸、氨基酸等的含量。单糖分析显示葡萄糖是最丰富的糖，其次是纤维二糖、核糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、果糖、海藻糖、半乳糖和阿拉伯糖。LTDQ显示出比其他两种大曲类型更高的葡萄糖水平。在三种类型的大曲中，葡萄糖醇和甘露醇是含量最高的多元醇。乳酸和乙酸是大曲中的主要有机酸，LTDQ中的乳酸含量高于MTDQ和HTDQ。氨基酸被广泛认为是大曲风味的主要来源，并能在发酵过程中为微生物提供丰富的营养。本研究在大曲中鉴定出12种氨基酸，其中含量最多的是脯氨酸、谷氨酸和丙氨酸。

细菌群落组成的比较

三种大曲的细菌群落绝对定量和相对定量结果如图1所示。LTDQ、MTDQ和HTDQ中前30个菌属的平均绝对丰度分别为6.0×10⁵、5.3×10⁴和1.4×10⁵拷贝/ng DNA，这表明LTDQ中的细菌负荷高于其他两种大曲，表明细菌群落根据最大培养温度有明显的区别，两种定量方法得到的结果一致（图1A）。此外，由两种定量方法生成的丰度矩阵用于LEfSe分析，两种定量方法中鉴定出三种显著不同的菌属。绝对定量结果显示LTDQ中Pediococcus、Leuconostoc和Paenibacillus的绝对丰度较高，但相对定量结果显示MTDQ中Pediococcus和Leuconostoc，以及HTDQ中Paenibacillus的相对丰度较高（图1B）。

图1、三种大曲样本中相对和绝对定量检测的细菌优势菌属(A)。LEfSe分析显示了共有的显著差异细菌分类群(B)。（原文图2）

真菌群落组成的比较

三种大曲中真菌群落的绝对和相对定量结果如图2所示。在LTDQ、MTDQ和HTDQ中检测到的前30个优势真菌菌属的平均绝对丰度分别为8.5×10⁷、2.1×10⁶和6.2×10⁵拷贝/ngDNA，表明真菌的绝对丰度也与大曲制备过程中的最高温度有关。其中Saccharomycopsis占真菌群落的80%以上（图2A）。相对和绝对定量的LEfSe比较结果具有完全不同，且有矛盾的结果。两种定量方法共有66个差异分类群，而绝对和相对定量的差异分类群数分别为41和43个。图2B显示了两种定量方法鉴定的15种不同的真菌分类群。绝对定量结果显示LTDQ在所有分类群中占有优势。相比之下，相对定量结果显示，在HTDQ和MTDQ中，分别有8个和7个显著较高的分类群。

图2、三种大曲样本中相对和绝对定量检测的真菌优势菌属(A)。LEfSe分析显示了共有的显著差异真菌分类群(B)。（原文图3）

噬菌体群落组成和功能的比较

三种大曲中噬菌体的群落组成在科水平结果如图3所示。Genomoviridae占LTDQ中噬菌体群落的89.23%，属于优势噬菌体。Mimiviridae和Siphoviridae是MTDQ中的优势科。在HTDQ中，Parvoviridae属于优势科（图3A）。在属的水平上三种大曲中共鉴定出197个属级噬菌体，主要的优势噬菌体属是Gemycircularvirus（图3B）。通过将病毒重叠群与CRISPR-Cas间隔数据库检索，发现三种大曲产生的10个噬菌体科水平共861个重叠群可以与5个宿主门匹配。在属水平上预测宿主时发现，共有79个细菌属被预测为噬菌体的潜在宿主。三种大曲噬菌体序列的主要KEGG途径富集分析显示，遗传信号传递和细胞过程，以及复制和修复是噬菌体群落的主要富集途径。此外，大曲中噬菌体的功能还涉及核苷酸代谢、氨基酸代谢、辅因子和维生素代谢、异生物质的生物降解和代谢以及脂类代谢等。

图3、不同类型大曲样品在科(A)和属(B)水平上的噬菌体组成。(C)大曲中噬菌体-细菌宿主连锁关系预测结果。（原文图4）

挥发性化合物组成的比较

采用HS-SPME-GC-MS技术检测了三种大曲中的挥发性成分，共鉴定出105种挥发性成分，包括6种酸、32种醇、8种醛、17种酯、4种呋喃、12种酮、10种含氮化合物、4种酚、2种含硫化合物、2种萜烯和8种其他化合物。HTDQ中挥发性化合物的含量高于其他两种类型的大曲。结果表明，异戊醛、乙酸乙酯、四甲基吡嗪、异戊酸、壬醛、二甲基三硫、3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2-戊醇、异丁酸、二甲基二硫、异丁醛和乙酸异丙烯酯等14种重要挥发性物质可作为鉴别三种大曲的潜在生物标志物。

微生物和代谢物之间的关系

根据实验结果，研究者构建了细菌和真菌的独立共现网络，并计算相关拓扑特征以识别大曲中的核心微生物（图4）。通过节点的模块分布，细菌网络包括4123条边和276个节点。所有节点被分成五个模块（图4A）。相比之下，真菌网络中共有1098条边和128个节点。所有节点被分成七个模块（图4B）。利用Mantel检验以确定细菌或真菌模块和大曲中检测到的每种重要挥发性化合物之间的相关性（图4C-D），发现这些微生物模块与多种挥发性化合物的含量呈显著相关。值得注意的是，苯乙醛与细菌模块2、3和4以及真菌模块2、3和6表现出显著的强相关性。异戊醛与细菌模块2、3和4以及真菌模块1、2、6和7具有显著强的相关性。四甲基吡嗪和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚与真菌模块3和6表现出显著的强相关性。

图4、基于ASV矩阵的细菌(A)和真菌(B)的共生网络，通过模块等级着色(连接代表强(Spearman r > 0.8)且显著相关。直方图显示了每个模块中属级分类群的组成和绝对丰度。(C-D)大曲中的细菌和真菌模块与重要挥发性物质网络的Mantel检验。（原文图6）

研究结论

本研究使用人工合成的spike-in序列的微生物绝对定量测序技术，用于综合比较不同类型大曲中微生物群落的相对和绝对丰度。检测三种大曲的挥发性成分也发现存在显著差异。大曲中共检测出105种挥发性化合物，其中14种被鉴定为区分三种大曲的重要化合物。相关性分析表明，这些代表性化合物的形成与Saccharopolyspora、Thermoactinomyces、Kroppenstedtia、Byssochlamys和Thermomyces密切相关。此外，本研究首次利用宏病毒组学观察了三种大曲中病毒的组成和功能。这将有助于更好地理解大曲微生物群，它可以通过噬菌体和它们的宿主之间的相互作用而改变。本研究强调了使用绝对定量以避免在比较微生物组分析中对差异分类群的误判，并为大曲中的噬菌体群落和功能提供了新的见解。研究者今后将进一步探索大曲中功能菌和噬菌体在温度驱动下的相互作用，以及它们对代谢产物形成和积累的影响。

天昊生物

Accu16S^®细菌与AccuITS^TM真菌绝对定量测序

专利技术简介

天昊生物一直秉承“自主研发、创新驱动”的发展理念，在微生物多样性检测领域潜心研发多年，率先于2019年和2021年在国内市场成功推出了Accu16S^®细菌和AccuITS^TM真菌绝对定量测序技术服务，并顺利申请了国家技术专利。我们的微生物绝对定量技术完美的解决了国内同类相对定量扩增子测序服务“只测比例，不知数量”的技术痛点，一个样本单次检测，即可同时获得样本微生物多样性的“相对比例”和“绝对数量”，让样本总菌和特定菌种的绝对数量结果唾手可得。

我们的服务一经推出，便获得了客户和市场的高度认可。截至目前，公司检测项目累计已达数百项，客户发表SCI文章32篇，其中1区文章高达10篇，5分以上文章也达到了23篇，这些数据充分说明天昊生物绝对定量专利技术已经得到了高水平杂志的普遍认可，在微生物多样性绝对定量检测领域处于国内领先地位。

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