【昊文章】郑树森院士团队最新成果：GNA14高甲基化及其在HCC中的抑癌作用！

原创上海天昊生物

昊文章

2021年元旦浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科郑树森院士和宋朋红教授团队于《Theranostics》杂志（IF：8.579）发文报道称GNA14基因高甲基化抑制其表达水平，而高表达的GNA14在乙型肝炎病毒（HBV）相关肝细胞癌（HCC）中发挥一定的肿瘤抑制作用，因而可能作为HCC潜在的标志物和治疗靶点。天昊生物在该研究中提供了甲基化数据分析及目的区域甲基化水平验证等服务内容。

一、数据分析发现GNA14作为HCC潜在甲基化相关的肿瘤抑制基因

为了获得HCC最重要的潜在肿瘤抑制基因，作者分析了TCGA和GSE94660中的mRNA表达数据及TCGA的DNA甲基化数据。从TCGA甲基化数据中获得了535个差异甲基化基因（图1A），TCGA表达数据中获取了1088个在HCC肿瘤组织中显著下调的基因（图1B）。对三个数据集取交集发现了两个重叠的基因GNA14和TBX15（图1C），GNA14表现出DNA甲基化水平上调（图1D），而mRNA表达下调（图1E），并且与HCC患者预后呈负相关，而TBX15并未显示出这一结果。因此，选定GNA14作为HCC的研究对象。

图1数据分析发现GNA14作为HCC潜在甲基化相关的肿瘤抑制基因

二、GNA14在HCC中表达显著下调

为了确定GNA14在HCC中的表达，利用qRT-PCR对收集的临床配对样本进行表达定量验证，结果发现GNA14 mRNA表达在肿瘤组织中显著下调（图2A-B）。此外，多株HCC细胞系表现出GNA14 mRNA表达水平更低（图2C）。多个配对样本和细胞系的GNA14蛋白水平同样显著更低（图2D-E）。ROC曲线分析GNA14在诊断TCGA数据库（AUC = 0.948）和本院HCC（AUC = 0.935）中表现出较好的灵敏度和特异性（图2F）。免疫组化显示与匹配的正常组织相比，肿瘤组织中GNA14表达降低（图2G）。此外，GNA14的表达与临床特征相关，在本院HCC标本中，HBV感染组织（4.55倍）和血管侵袭组织（2.63倍）中GNA14 mRNA表达显著下调。在低分化组织（4.6倍）和复发患者组织（6.47倍）中，GNA14表达也显著降低（图2H）。

图2 GNA14在HCC中表达显著下调

三、HCC中GNA14启动子呈高甲基化

为了探究GNA14在TCGA中的甲基化状态，使用Shiny methylation Analysis Resource Tool (SMART)进行分析。结果发现GNA14的三个探针（ch9.991104F，cg12687527和cg17301902）在肿瘤组织中显示出甲基化上调（图3A）。另外TCGA数据显示GNA14甲基化水平和mRNA水平呈负相关（图3B），而且GNA14高甲基化与HCC预后差相关（图3C）。

利用METHPRIMER（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）分析GNA14启动子区域发现两个明显的CpG岛，对12对HCC样本检测这两个CpG岛的甲基化水平，通过DNA甲基化测序发现其中一个CpG岛（基因组区域80262823-80262968）在肿瘤中呈高甲基化（图3D）。GNA14 mRNA表达水平与DNA甲基化测序区域的甲基化水平同样呈现显著负相关（图3E）。肝癌细胞株（SK-Hep-1，HCCLM3，Hep3B和PLC/PRF/5）和正常肝细胞株（L02，HepLi5）也用于甲基化水平检测。甲基化测序结果显示，与正常肝细胞相比HCC细胞甲基化状态上调，特别是在SK-Hep-1、Hep-3B和PLC/PRF/5细胞中（图3F）。ChIP-qPCR分析显示，在SK-Hep-1和Hep3B细胞中，DNMT1和DNMT3A与GNA14启动子区结合（图3G）。在SK-Hep-1细胞中敲除DNMT1和DNMT3A后，甲基化测序显示CpG岛甲基化水平下调（图3H），而GNA14蛋白表达升高（图3I）。用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷刺激肝癌细胞系（SK-Hep-1，PLC/PRF/5，Hep3B，HCCLM3，HepG2和Huh7）48h后，除HCCLM3外，GNA14 mRNA水平均显著升高（图3J）。DNA甲基化测序结果显示，5-氮杂胞苷处理的肝癌细胞系（SK-Hep-1, Hep3B）的DNA甲基化水平显著下调（图3K）。总结以上结果可以发现肿瘤中GNA14表达的下调可能是由于其启动子区DNA甲基化水平上调所致。

图3 HCC中GNA14高甲基化导致其表达下调

四、HBV编码的X蛋白（HBx）引起GNA14启动子高甲基化

TCGA数据库显示，HBV感染患者GNA14 mRNA水平更低（图4A）。因此，检测了10例HBV感染患者和10例未感染患者肿瘤组织中GNA14蛋白水平，发现HBV感染患者的GNA14水平较低。另外HBV阳性的HCC组织GNA14水平低于正常组织，而HBV阴性的HCC组织GNA14水平不显著（图4B）。此外，SMART分析TCGA甲基化数据库发现GNA14启动子（ch9.991104F，cg12687527，cg17301902）的甲基化水平与HBV感染相关（图4C）。

HepG2.2.15是一种来源于HBV基因组DNA感染HepG2后的HCC细胞系。与HepG2相比，HepG2.2.15中DNMT1和DNMT3A的蛋白和mRNA表达量显著升高，而GNA14的蛋白和mRNA表达量下降（图4D）。

HBx已被证实通过影响DNMTs来调控DNA甲基化，作者使用Co-IP验证HBx与DNMT之间的关系，确认HBx与DNMT1、DNMT3A存在物理相互作用。而HBx与GNA14之间无相互作用。敲低HBx后降低了HepG2.2.15细胞中DNMT1和DNMT3A的表达，但上调了GNA14的表达（图4D-E）。将HBx过表达质粒转染HepG2细胞，观察到HBx过表达组DNMT1、DNMT3A上调，而GNA14下调（图4D）。转染HBx过表达质粒后，用RNA干扰敲除DNMT1或DNMT3A可挽救GNA14的表达。同时敲除DNMT1和DNMT3A显著增加了GNA14的表达（图4D）。

双荧光素酶报告系统进一步探索了HepG2、HepG2.2.15、HCCLM3和L02细胞中GNA14启动子活性的变化（图4F）。除了野生型GNA14启动子荧光素酶报告基因系统（wt）外，还构建了甲基化靶点缺失的突变型GNA14启动子荧光素酶报告基因系统（mut，图4F）。在wt组中，与HepG2细胞相比，HepG2.2.15细胞中的启动子活性显著下调（图4G，左图）。但当目标甲基化位点发生缺失突变时，两种细胞系之间的差异消失了（图4G，右图）。当HBx在HepG2、HCCLM3和L02中过表达时，GNA14启动子活性下调，但当目标甲基化位点发生突变时，活性可以恢复（图4H）。作者还用siRNA敲除HepG2.2.15细胞中的HBx、DNMT1和DNMT3A。在相应的敲除组中，GNA14启动子的活性显著升高。然而，当靶DNA甲基化位点发生缺失突变时，GNA14启动子的活性变化被消除（图4I）。

综上所述，HBx通过调控DNMT1和DNMT3A，影响GNA14启动子的DNA甲基化，导致GNA14表达下调。

图4 HBx引起GNA14启动子高甲基化

五、GNA14抑制HCC增殖和转移

为了研究GNA14在HCC中的功能，研究人员首先利用HCC细胞系研究对细胞增殖的影响，结果发现GNA14过表达显著抑制细胞活性，并且增加了G0/G1期细胞比例，降低了S期细胞比例，同时GNA14过表达降低了克隆形成的数量。进一步研究GNA14对肿瘤生长的影响，GNA14过表达组的人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长受到抑制，肿瘤大小和肿瘤显著降低。作者在研究中观察到GNA14和Notch1存在共定位的现象，因而，进一步通过实验证实了GNA14通过促进Notch1切割抑制了HCC增殖（图5）。

图5 GNA14通过促进Notch1切割抑制HCC增殖

分析GNA14对肿瘤转移的影响，发现过表达GNA14显著抑制HCC细胞迁移和侵袭，小鼠体内实验同样表明GNA14过表达与HCC转移减少相关。JMJD6蛋白可能与GNA14存在相互作用，免疫荧光实验进一步证实了GNA14和JMJD6共定位于HCC细胞的细胞质和细胞膜。GNA14抑制HCC转移的作用可能通过抑制JMJD6的表达来实现（图6）。