【昊文章】上海六院最新研究成果发现Paget's骨病新致病基因！

原创上海天昊生物

近日，上海交通大学附属第六人民医院骨质疏松和骨病专科，上海市骨疾病临床研究中心章振林教授和岳华教授课题组发现了畸形性骨炎（Paget’s骨病，Paget’s Disease of Bone，PDB）新的致病基因Profilin 1（PFN1），相关研究成果于2021年2月发表在骨矿盐领域权威杂志Journal of Bone and Mineral Research（JBMR）杂志上，魏哲博士作为论文的第一作者。该项目由科技部重大研发项目（2018YFA0800801）和国家自然科学基金（81974126、81770874）资助。

在该研究中天昊生物有幸承担了样本的外显子组测序和一代测序验证工作，下边将文章的主要研究内容分享给大家。

Paget’s骨病（PDB）是一种慢性进展性代谢骨病，以破骨细胞的异常激活为特征，导致骨吸收增加和代偿性骨形成、骨硬化。PDB能够影响骨骼的某个或多个区域，伴有多种临床表现，包括骨痛、骨骼和关节畸形、病理性骨折、耳鸣、听力下降以及视力丧失等。

骨肿瘤是PDB最严重的并发症，其中最常见类型为骨肉瘤，发生率为1%，其风险增加是普通人群的数千倍。其次还可并发纤维肉瘤、软骨肉瘤以及骨巨细胞瘤（Giant Cell Tumor，GCT），其中合并GCT非常罕见，并且这一疾病的发病机理仍不明确。

遗传是PDB发病的重要因素之一，报道发现SQSTM1、TNFRSF11A、TNFRSF11B、VCP、HNRNPA2B1等基因的突变与PDB相关。ZNF687曾被报道与意大利南部几例PDB/GCT患者有关，然而，PDB和PDB/GCT的分子机制仍未完全解析，上述的已知基因只能解释其中一小部分病例。

课题组于2017年和2019年分别收集到两个早发型PDB伴GCT（PDB/GCT）家系样本，其中家系一包含祖孙三代24位成员，10位成员以常染色体显性方式被诊断为PDB（图1，诊断资料详见原文），所有的患者呈现出PDB多骨侵犯（至少3个部位骨骼受累），并且发病年龄呈早发型。家系二包括母子两代4位成员，先证者和其母亲以常染色体显性方式被诊断为PDB（诊断资料详见原文）。这项研究同时纳入了30例PDB散发患者，这些患者均未检测出与PDB相关的已知基因突变。研究另外招募了570名健康汉族人群志愿者作为对照，检测健康人群中的突变频率。

图1 家系一家系图及影像学特征

为了发现PDB/GCT的致病基因，研究人员对家系一15位成员进行连锁分析，并对患病的6位成员（II-2、II-4、II-5、II-9、III-4和III-9）进行全外显子组（WES）测序。多点参数连锁分析在染色体17：8、547-5、657和423的LOD分数最高，为2.70（图2A）。研究通过WES鉴定出73个功能变异，但只有2个在关键连锁区域内。进一步通过Sanger测序发现只有1个与疾病表型显示出精确的共分离：PFN1基因的c.318_321delTGAC杂合突变（p. Asp107Argfs*3），编码Profilin 1蛋白，该基因位于染色体17p13（图2B）。该突变位点4bp的缺失会导致一个提前终止密码子的移码突变，形成一个由108个氨基酸而不是140个残基组成的蛋白。研究人员又利用Sanger测序在1例散发患者中发现了PFN1基因的另一个相邻位置的缺失突变（图2B），c.324_324delG杂合突变（p.T109Rfs*2）。而在家系二成员（I-2）中鉴定到PFN1的c.335 T > C错义突变（p.Leu112Pro，图2B），这些研究结果表明PFN1的截短型突变和错义突变均是PDB/GCT的致病突变，而在健康对照中并未发现以上类型的突变。

图2 PFN1基因在PDB/GCT家族性或散发患者中的突变类型

接下来研究人员在113例单纯GCT患者的肿瘤样本中分析PFN1基因是否存在体细胞突变，结果并未检测出PFN1体细胞突变存在。为了验证患者的破骨细胞是否具有典型的Pagetic破骨细胞特征，研究人员分别从健康对照和患者（家系一III-9）的外周血中分离出单个核细胞，并将其向破骨细胞诱导分化。正如预期，研究人员观察到PFN1突变的PDB患者破骨细胞数量及大小远高于对照组（图3）。

图3 PFN1突变患者和健康对照PBMC破骨细胞分化活性

为了研究PFN1突变在PDB发病机制中的功能，利用CRISPR-Cas9技术构建了Pfn1突变小鼠，Pfn1 c.318–321缺失纯合突变对于小鼠胚胎形成是致死的，Pfn1^+/mut小鼠与野生型（WT）小鼠相比，突变小鼠从出生到成年，体型较野生型更小，体长和股骨长度缩短，颅面骨和脊柱表型明显差异（图4A）。MicoCT 3D重建显示与WT小鼠相比，Pfn1^+/mut小鼠的颅缝较宽，颅面骨和脊柱后凸畸形（图4B）。另外，Pfn1^+/mut小鼠骨小梁参数显示较WT骨量明显减少（图4C）。

图4 WT和Pfn1^+/mut小鼠外貌和3D重建比较

为了进一步评估Pfn1突变是否影响破骨细胞分化，分离WT和Pfn1^+/mut小鼠骨髓巨噬细胞，诱导其分化成破骨细胞。研究发现，Pfn1^+/mut小鼠的破骨细胞数量显著高于WT小鼠（图5A, C）。

此外，吸收陷窝形成实验显示，来自Pfn1^+/mut小鼠的破骨细胞形成的吸收陷窝更大、更深，骨吸收能力更强（图5B）。这表明该突变导致破骨细胞的骨吸收活性明显增强，这与PDB患者活跃的骨吸收表型一致。

骨转换标志物反映骨形成和骨吸收的活性。通过ELISA检测了P1NP和TRACP-5b的表达水平，结果显示与WT小鼠相比，Pfn1^+/mut小鼠的P1NP和TRACP-5b均显著升高（图5D），表明Pfn1^+/mut小鼠骨转换活跃。这也与PDB患者骨吸收活性增强相一致。

图5 Pfn1截短型突变导致小鼠破骨细胞分化加速及骨吸收增加

另外，采用HE染色比较8周龄小鼠股骨远端骨组织差异，发现与WT小鼠相比，Pfn1^+/mut小鼠的骨小梁数量减少且结构紊乱（图6A）。随后，研究人员利用TRAP对Pfn1^+/mut小鼠和WT小鼠破骨细胞进行染色，在Pfn1^+/mut小鼠干骺端检测到大量的多核TRAP阳性细胞，而在WT小鼠中破骨细胞数量很少（图6B）。接着利用免疫组化染色评估Profilin 1在骨组织中的表达情况，结果显示：与WT小鼠相比Pfn1^+/mut小鼠的Profilin 1蛋白表达显著降低（图6C），这与Profilin 1的截短突变导致编码蛋白功能丧失一致。

图6 WT和Pfn1^+/mut小鼠股骨远端骨组织学检测

综上，这项研究报告了PFN1基因的三种不同突变，包括两种截短突变和一种错义突变。上述突变位点导致了早发型PDB/GCT严重的临床表型。建立的Pfn1基因截短突变的小鼠模型表现出PDB样骨表型，证实了Profilin 1蛋白功能缺失可能通过激活NF-κB通路，导致PDB/GCT发生。在本研究中，证实Pfn1截短突变小鼠为研究PDB相关病理机制的理想模型，将极大地帮助我们在未来揭示人类早发型PDB的病因和病理机制。同时这项研究也拓展了PDB的致病基因谱。PFN1基因突变的鉴定对于鉴别PDB中易发生GCT的个体具有重要诊断价值，此外PFN1突变导致PDB/GCT的确切分子机制还有待进一步研究。

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