植物转录组高效发文最新案例

原创上海天昊生物

英文题目：Characterizing the Leaf Transcriptome of Chrysanthemum rhombifolium (Ling et C. Shih), a Drought Resistant, Endemic Plant From China

中文题目：中国特有抗旱植物菱叶菊叶片转录组特征分析

期刊名：Front Genet.

影响因子：3.258

发表时间：2021-2-11

摘要一览

菱叶菊是一种非常适应恶劣环境的特有植物，然而人们对它的植物抗逆特性的分子生物学，甚至对它的整个植物的分子生物学知之甚少。为了研究菱叶菊的分子生物学和胁迫适应机制，本研究利用Illumina平台对其叶片进行了转录组测序。共获得130,891个单基因，在公共蛋白质数据库中注释了97,496个(~74.5%)单基因。相似性搜索表明，40,878和74,084个单基因分别与NCBI非冗余和Swissprot数据库中的已知蛋白质显示出显著的相似性。其中，56,213个和42,005个单基因分别被分配到基因本体(GO)数据库和同源群聚类(COG)数据库，38,918个单基因被映射到五个主要类别，包括18个KEGG途径。代谢是主要KEGG类别中最大的类别，表明菱叶菊具有活跃的代谢过程。大约2459个单基因被注释为在防御机制或应激耐受中起作用。菱叶菊的转录组分析显示，在10,524个单核苷酸和具有较高多态性的单核苷酸、三核苷酸和二核苷酸中存在12,925个微卫星。基于GME基因的亲缘物种系统发育分析证实了转录组数据的可靠性。本工作是首次对菱叶菊作为一种新的植物抗逆基因资源的遗传研究。这大量的转录组序列使研究者能够全面了解菱叶菊的基本遗传学，并发现有助于菊花新基因的分子改良。

研究背景

菊花是我国最受欢迎的花卉之一，也是世界上最重要的切花，具有很大的观赏价值和经济价值。然而，菊花的长期人工驯化往往导致其对环境压力的抵抗力和适应性下降，从而限制了它们在园林绿化和工业生产中的使用。因此，在野菊花种中鉴定出许多抗逆性状及相应的抗逆基因资源，对菊花品种的遗传改良具有重要意义。

RNA测序(RNA-Seq)是使用深度测序技术对不同类型的RNA分子进行定量和分析的有力工具。它为研究者提供了高通量、高准确度、高灵敏度和高重现性的大规模转录数据，使研究者能够生成该物种转录组的前所未有的全球视图。RNA-seq在植物中得到了广泛的应用，特别是对于一些非模式物种和一些大而复杂的基因组，大大加快了新基因的发现，了解复杂的组织特异性表达模式，以及高等植物中的调控网络。

菱叶菊是重庆巫山特有的多年生草本植物，并具有很高的观赏价值。它有菱形的叶子，背面有浓密的短柔毛和半木质化的茎和枝(图1)。本种很好地适应以高温、低土壤肥力和干旱为特征的环境。然而，除了作为菊花分子系统发育的样本外，很少对菱叶菊进行研究。在这里，很少有人知道它对整个植物的分子生物学或植物对胁迫的抗性特征。这促使研究者利用高通量RNA测序和从头组装来表征其叶片转录组，为理解菱叶菊的生物学提供了全面的资源，并在改进菊花和其他相关作物的育种方面获得了见解。

研究方法

本研究的植物材料是从中国重庆巫山采集获得的。新鲜成熟的叶子用无菌水清洗，立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃，之后用于RNA-seq检测。测序采用Illumina HiSeq 2500平台进行。质控后，使用Trinity软件用于从头转录组组装。

单基因的功能注释和分类分析使用NCBI Nr、NCBI Nt、Swiss-Prot、GO和Pfam对获得的单基因进行注释，还使用蛋白质直向同源群簇(KOG/COG)和KEGG数据库进行功能注释，分别对可能的COG功能和KEGG途径进行分类，并预测可能的功能分类和分子途径。

系统发育分析使用GDP-D-甘露糖3’,5’-异构酶(GME)进行，它是调节细胞壁生物合成和抗坏血酸积累的，在植物发育和非生物胁迫耐受中发挥重要作用。研究者提取了带有注释的GME单基因序列，并将其与从Genbank检索到的其他GME同源基因进行比对。多重比对是使用MUSCLE软件并手动调整。研究者通过使用MEGA软件的1,000个自举重复的邻近连接(NJ)方法构建了系统进化树。

SSR预测利用MIcroSAtellite预测了所有组装的单基因中的SSR区域。研究者使用默认设置检测了核苷酸的SSR基序。

图1、菱叶菊植物表型图。

研究结果

非冗余单基因的功能注释和分类

在用Illumina双端测序和组装后（表1），研究者使用Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-prot、GO和KEGG数据库来注释组装的单基因。在获得的130，891个单基因中，至少97，496个单基因(74.48%)可以用搜索的数据库进行注释——40，878 (Nr)、55，831 (Nt)、37，488 (KO)、74，084 (Swiss-prot)、56，213 (Pfam)、56，213 (GO)和42，005 (KOG/COG) (表2、图2)。

表1、菱叶菊转录组序列组装概述。

表2、菱叶菊组装单基因功能注释。

图2、菱叶菊在Nr数据库中的比对率(%)。

COG分析实现了42，005个单基因的功能分类(图3)。最常见的类别是“翻译、核糖体结构和生物发生”(7，147；17%)，其次是“翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣蛋白”(6，016；14.3%)，“能源生产与转换”(4830；11.5 %)，“仅一般功能预测”(4，706；11.2%)，“氨基酸转运与动力学”(2407；5.7%)，“细胞内转运、分泌和囊泡转运(2218；5.3%)，“信号转导”(2145；5.1%)、“脂质转运与代谢”(2065，4.9%)和“碳水化合物转运与代谢”(2057；4.9%).最不常见的组是“核结构”(183；0.4%)，“细胞外结构”(36；0.09%)和“细胞能动性”(24；0.06%)。本研究发现了205个属于“防御机制”的单基因，表明菱叶菊中存在抗逆基因。

图3、菱叶菊转录组中单基因的COG分类。

根据Nr注释，将42，005个单基因分配给3个本体，并使用Blast2GO软件将其分为48个功能性GO类别。其中，1050 (68.5%)、163 (10.6%)和320 (20.9%) GO术语分别与细胞成分、生物过程和分子功能相关(图4)。本研究中菱叶菊GO术语的赋值集中于“细胞过程”、“代谢过程”、“单有机体过程”、“细胞”、“细胞部分”、“大分子复合物”、“膜部分”、“细胞器”和“结合和催化活性”，反映了其正常生长过程中的功能基因表达特征。这一结果与一些抗旱物种的GO术语相似，主要是由于各种环境和生理状态引起的选择性基因表达。

图4、基于GO的菱叶菊功能分类。

基于对KEGG数据库的序列同源性搜索，56，213个单基因被分配到5个本体，并被分为18个功能性KEGG途径(图5)。在这些途径中，“翻译途径”(6，912；12.3%的KEGG单基因)是“代谢”中最大的类别，其次是“碳水化合物代谢”(4，876)、“概述”(4，496)、“氨基酸代谢产物”(3，306)、“折叠、分类和降解”(3，112)、“能量代谢”(2，663)、“转运和分解代谢”(2，297)和“脂质代谢”(2，168)。在本研究中，研究者强调了植物与其环境相互作用的丰富途径，包括:“萜类化合物和聚酮类化合物的代谢”(752)、“信号转导”(592)、“环境适应”(719)和“复制和修复”(396)。

图5、基于KEGG的富集通路分析。

SSR频率和分布

总共在10，524个单基因中鉴定出12，925个SSR区域。在鉴定的SSR中，鉴定了128个不同的基序，其分布和频率如图6所示。单核苷酸基序最丰富，A/T是最大的子集(6，328)。总的来说，在菱叶菊叶转录组中发现了6，429个单核苷酸、2，463个二重复、3，694个三重复、199个四重复、56个五重复和84个六重复。在含有单基因的SSR中，941个SSR呈现复合形成，1，874个包含一个以上的SSR。平均每8.17 kb发现一个SSR。菱叶菊的大量EST-SSR位点可能是由其恶劣的生境造成的。这些无害环境技术将为未来的功能性SSR研究提供一个有价值的信息库。

图6、菱叶菊转录组中存在SSR类型分析。

GME的系统发育分析

利用GME在菱叶菊和其他GME同源物中的注释序列，研究者构建了一个亲缘物种的进化树。来自同一分类群的所有GME序列聚在一起，菱叶菊中的GME序列与向日葵和其他菊科物种的序列归为一个分支(图7)，这一结果揭示了菱叶菊和其他菊科物种的密切关系，这与基于形态学的分类学一致。

图7、植物GME的系统发育分析。

研究结论

通过NGS转录组学方法，研究者从菱叶菊叶中获得了130，891个单基因，其中97，496个(~74.5%)单基因在公共蛋白质数据库中被成功注释。在10，524个单基因中共检测到12，925个SSR。这是首次对菱叶菊作为抗逆基因植物资源的遗传学研究。这些大量的转录组序列使研究者能够全面了解菱叶菊的基本遗传学，并发现有助于菊花分子改良的新基因。

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