转录组测序+SSR鉴定，文章可以轻松发

原创上海天昊生物

转录组测序完后，很多老师最关心的就是样本中差异表达的基因有哪些，涉及到哪些生物功能及代谢通路等。然而对于一些物种样本而言，在转录组测序基础上，进一步开发SSR分子标记，深入挖掘物种中的遗传多样性等信息，可以从另一个角度快速成文，今天小编就跟大家分享一篇近期发表的经典范例。

题目：The development of SSR markers based on RNA-sequencing and its validation between and within Carex L. species

基于RNA测序的SSR标记的开发及其在苔草种间和种内的验证

发表期刊：BMC Plant Biol.

发表时间：2021-1-6

影响因子：3.497

研究摘要

苔草属（Carex L.）是莎草科最大的属之一，也是生态系统中重要的维管植物。但苔草的遗传背景复杂，分类不明确。为了研究苔草的基因功能注释，进行了RNA-seq分析。根据Illumina的测序数据生成SSR，然后用于研究79份苔草种质的遗传特性。在本研究中，共获得36,403个单基因，总长度为41,724,615 bp，并基于GO、KOG、KEGG、NR数据库进行注释。在8776个SSR中，随机选择了96对引物。42对多态性较高的引物共扩增出180条多态性带。每个引物的平均条带数为4.3，平均距离值为0.548，多态信息含量为0.133-0.494。观察到的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei's基因多样性(H)和Shannon信息指数分别为2.000、1.376、0.243和0.391。NJ聚类分为三组，来自新西兰的材料表现出相似的遗传属性，聚类成一组。UPGMA和PCoA分析也显示了相同的结果。AMOVA分析表明，基于地理起源聚类和NJ聚类的种内遗传多样性优于种间遗传多样性。此外，本研究还建立了79种苔草的指纹图谱。引物对的不同组合可以一次鉴定多种苔草，克服了传统鉴定方法的困难。转录组分析从基因注释中揭示了新的功能类别。遗传特征分析表明，79种苔草属植物间存在广泛的基因流动。这些标记可用于调查苔草和相关物种的进化史，以及作为未来育种项目的指南。

研究方法

使用HiSeq2000平台进行转录组测序，利用TRINITY、TGICL等软件进行从头组装和功能注释，使用MISA和Primer等软件SSR的鉴定和引物设计，用POPGENE进行遗传多样性分析，使用NTSYS、PowerMarke、MEGA和GenAlEx等软件对79份材料进行聚类分析和AMOVA等分析。

研究结果

RNA-seq及从头组装

使用HiSeq2000平台对青绿苔草的转录组进行测序。总共获得了43.67Gb的数据。每个样本的数据达到6.32Gb，Q30百分比超过94.03％。总共有36,403个单基因，其中12,657个单基因的长度超过1 kb。单基因的N50为2016，表明具有很高的组装完整性。

基于不同数据库的基因注释

根据序列的同源性分析，将11,629个单基因（31.95％）分为三个主要的GO类和50个子类。根据KOG数据库，将11,871个单基因分为25个功能组，并将20.52％的单基因注释为“一般功能”群。基于KEGG数据库，总共发现了8440个单基因，包括属于五个大类（细胞过程，遗传信息处理，环境信息处理，代谢和生物系统）的40条生物途径（图1）。

图1、基于GO、KOG和KEGG数据库的基因标注结果。

基于NCBI非冗余核苷酸数据库，E值分布显示有23.00%的单基因搜索到结果(图2a)，约35.00%的单基因表现出大于80%的同一性(图2b)。NR蛋白序列比对结果显示，21.69%可与菠萝属植物比对，10.10%可与杜鹃花属植物比对，8.03%可与凤凰属植物比对(图2c)。

图2、青绿苔草unigene同源性检索及非冗余蛋白数据库(Nr)特征分析。

转录组中SSR的频率和分布

使用MISA软件共扫描了36,403个单基因，检测到8776个SSR位点(表1)。转录组中的SSR位点有六种类型，每种重复类型的数量差异很大。

图3、转录组数据集中鉴定的SSR类型分布。

SSR的开发及评价

我们设计并合成了96对引物来扩增11个表型差异材料，其中42对(43.75%)可扩增多条条带，多态性高。引物表明不同苔草属物种之间具有良好的可转移性。未扩增条带数占15.6%，其余多态性较低或无多态性。

遗传多样性统计

在42个SSR中，我们识别了79份材料中的180个标记等位基因。42个SSR中，PIC值在0.133 ~ 0.494之间，平均为0.259。SSR在不同材料间表现出较大的遗传变异。采用聚类分析、主成分分析对苔草材料间的遗传多样性进行了研究。平均每个引物扩增出4.3条引物。观察到的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei(1973)基因多样性(H)和Shannon信息指数(I)分别为2.000、1.376、0.243和0.391，表明苔草种间的遗传多样性较高。

基于SSR标记的苔草属植物聚类分析

为了揭示苔草属物种的分类信息，我们根据原始数据获得了等位基因频率。我们使用NJ、PCoA和UPGMA聚类分析，而不是使用种源或分类等先验分类，并结合这些结果来探索所有材料的遗传信息和分类。

主坐标分析(PCoA)结果得到了两组遗传分化的苔草属材料(图4)。第一主成分占29.6%，第二主成分占19.8%。

图4、苔草属79种样本的PCoA分析。第一主成分占29.6%，第二主成分占19.8%。红色菱形代表中国的种质资源，绿色正方形代表新西兰的种质资源，蓝色三角形代表北美的种质资源，黄色圆圈代表德国的种质资源。

基于Shered等位基因距离计算方法，NJ系统发育分析将79份苔草属植物资源分为3组(图5)。

图5、79份苔草属植物的系统发育树。NJ树包括三个主要簇，其中第一组(22份)为蓝色，第二组(24份)为绿色，第三组(33份)为红色。

在SSR原始数据的基础上，采用Dice系数法计算相似度。采用UPGMA法对79份材料进行聚类分析(图6)。基因型间的相似度为0.070 ~ 0.786。通过UPGMA聚类，将79份种质资源分为两大类。关于苔草的收集来源，中国与新西兰、德国和北美的苔草种质之间存在一定程度的基因交换。然而，总的来说，资源不能完全按地区分配。相关系数r = 0.941，表明聚类结果可靠。

图6、79份苔草的聚类分析。

为了评估这些种质之间的遗传差异，我们计算了所有材料对之间的FST值。通过不同来源的分析，AMOVA表明79份材料的总遗传变异中88%在群体内，12%在群体间。AMOVA分析结果显示，部分亚种在国家间存在较大差异，这与上述不同国家材料的结果一致。而基于NJ聚类分析的AMOVA分析结果显示89%在人群内(表2)。