南京师范大学地理科学学院近期在《Applied Microbiology and Biotechnology》上发表了还原性土壤消毒与化学性土壤消毒对土壤真菌群落及成员不同影响的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目：Distinct impacts of reductive soil disinfestation and chemical soil disinfestation on soil fungal communities and memberships
中文题目：还原性土壤消毒与化学性土壤消毒对土壤真菌群落及成员的不同影响
期刊名：Applied Microbiology and Biotechnology     
发表时间： 2018年6月    
影响因子：3.42 
研究背景:
        土壤消毒是克服土传病害（土传病害是指病原体生活在土壤中,条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害），保证作物生产效率的重要农业实践。还原性土壤消毒（RSD）已发展成为一种对环境无害的可替代化学土壤消毒（CSD）的方法。然而，目前对CSD和RSD在土传病原体抑制和真菌群落结构上的差异仍知之甚少。
研究对象：田间试验位于云南石屏县，这个地区以亚热带季风气候为特征，年平均气温和降水量分别为18°C和899毫米。实验地连续种植4年洋桔梗，因此遭受严重的镰刀菌枯萎病。实验包括五个组别：1）未处理的土壤（CK）；2）CSD相关组：使用0.5 t ha ⁻¹棉隆处理的土壤（DZ），3）RSD相关组：使用10 t ha ⁻¹乙醇处理的土壤（ET）；4）RSD相关组：使用15 t ha ⁻¹甘蔗渣处理的土壤（SB）；5）RSD相关组：使用15 t ha ⁻¹豆渣处理的土壤（BD）。每组3个生物学重复。采用白色塑料薄膜（80μm厚）作为土壤覆盖物，用于DZ，ET，SB和BD的处理，厌氧处理持续4周，土壤温度保持在35℃-40°C。厌氧处理后，去除塑料薄膜。随机抽取土壤样品（0～20 cm），每个土壤样本是10个土芯的混合物，采集的土壤样品为过2毫米筛网，均质化，然后分为两份子样品，一部分4℃保存用于测量微生物活性和理化性质，另一部分保存于80°C进行DNA提取及后续分子分析。
土壤理化分析：测定土壤pH值和电导率（EC）。
微生物活性测定：利用荧光素二乙酸酯（FDA）水解方法测定总微生物活性。
真菌与尖孢镰刀菌丰度测定：使用real-time PCR测定真菌和F.oxysporum丰度。
测序技术：真菌ITS1扩增子测序
研究结果：
土壤理化性质
        4周厌氧处理后BD处理组土壤pH值显著高于对照组，在DZ, ET和SB处理组略微增加，但是与CK组相比不显著（表1）。
        所有RSD相关处理组（ET、SB和BD）中的土壤电导率均显著低于对照和DZ处理组，CK和DZ之间差异不显著。
        与对照相比，所有RSD相关处理组和DZ处理组土壤的NO ^{3 −}含量显著降低。

土壤微生物活性
        与CK处理相比，BD处理组土壤微生物活性显著提高，但是在DZ处理组则显著下降（P＜0.05）。CK、ET和SB等组别之间的土壤微生物活性无显著性差异。

真菌与尖孢镰刀菌的丰度
        不同的土壤消毒处理对真菌种群影响不一样，与对照组相比，BD处理后真菌丰度显著增加，DZ处理后真菌丰度显著减少（图2A）。
        令人惊讶的是，与对照组相比，所有的土壤消毒处理组（DZ、ET、SB和BD）显著降低了尖孢镰刀菌丰度（图2B）。
        尖孢镰刀菌/真菌的比例从CK处理14.06‰分别下降到DZ（0.32‰）、SB (0.15‰)、ET (0.12‰)、BD (0.01‰) （图2C）。

真菌α-多样性与β多样性
        从15个土壤样品（5个处理×3个生物重复）共获得1675743条高质量ITS序列，每个样品测序序列范围从68287到249183。按97%序列同源性聚类为1915个OUT，所有样品的覆盖率均在99.7%以上。
        总体而言，真菌Chao1，Shannon，和Pielou’s evenness在不同处理组显著不同（表2）：在CK处理Chao1最高，其次是DZ和ET，SB和BD。Shannon diversity和Pielou’s evenness在DZ组要高于SB和BD组，SB组的Shannon diversity和Pielou’s evenness最低。

        CSD（DZ）和RSD（ET、SB和BD）的真菌群落结构不同（图3），SB和BD的真菌群落结构聚集在一起，但是ET组明显不同。聚类分析进一步表明，所有处理的真菌群落结构形成了两个主要类群：SB和BD为一个集群，而CK, ET, DZ为另一个集群（CK和ET在一起，与DZ处理分离）。

 
真菌群落组成
         Sordariomycetes, Pezizomycetes, Dothideomycetes, Agaricomycetes, Eurotiomycetes, Saccharomycetes是所有样品中6类主要菌纲。
        与CK处理相比，CSD和RSD相关处理主要改变了排名前20的真菌属（图4），例如，镰刀菌属的相对丰度从CK处理（2.67%）显著降低到DZ（1.23%）、ET（0.17%）、BD（0.03%）和SB（0.02%），表明RSD相关处理比DZ处理在抑制镰刀菌属方面更有效。
        Ascobolus, Peziza, Candida, Pseudeurotium, Cladorrhinum丰度在SB和BD处理中增加； Lectera, Cryptococcus, Cladosporium, Phoma, Podosphaera在DZ处理中增加；Mycothermus, Conocybe在ET处理中增加；Zopfiella, Talaromyces, Coprinopsis在土壤消毒处理中则减少，这些结果表明，不同的真菌属对CSD和RSD相关处理的反应不同。

        不同的土壤消毒处理对特异和共有OTUs具有区别影响（表3；图5）。总的来说，所有处理组中特异和共有OTUs个数分别为394和63（表3）。CK、DZ、ET、SB和BD特异OTUs个数分别为166、101、88、17和22。

        在所有处理中，共有OTU的绝大多数隶属于15个菌属，其中Cercophora, Mycothermus, Remersonia, Fusarium, Coprinopsis, Ascobolus, Phoma, Candida的相对丰度在不同处理间变化显著（图5A）。
        需要指出的是，镰刀菌属的相对丰度从CK（5.54%）显著降低到DZ（1.43%）、ET（0.22%）、SB（0.02%）和BD（0.03%）。与CK组相比，Ascobolus丰度在DZ, SB, BD显著增加，Cercophora和Remersonia丰度显著降低。Mycothemus和Zopfiella丰度在DZ和ET中富集。Phoma丰度在DZ组显著增加。
        与共有OTUs结果一致，所有处理中17.19～66.31%的特异OTUs被分为32个属。CK, DZ, ET, SB, BD的特异菌属个数分别为8, 15, 6, 6, 6。
        有趣的是，低丰度镰刀菌属仅在CK处理中发现，表明所有土壤消毒处理可能能够抑制整个镰刀菌属。在DZ处理中，Mortierella属显著增加，而Penicillium属仅在RSD-相关处理中发现。此外，Zopfiella属和Chaetomium属在BD处理中显著增加。

研究结论：
        1. RSD相关处理，特别是BD处理，有效缓解了土壤酸化和盐渍化。
        2. 与CK处理相比，真菌的丰度和微生物活性在BD处理中显著增加，在DZ处理中显著下降。
        3. 此外，CSD和RSD处理均显著抑制尖孢镰刀菌种群和镰刀菌属的相对丰度，CSD和RSD显著改变了真菌群落结构。此外，CSD和RSD都具有独特的微生物群，DZ处理以被孢霉属Mortierella为主，BD处理以柄孢壳属Zopffela、毛壳菌属Chaetomium和青霉属Penicillium为主。
        4.  综上所述，这些结果表明，BD处理可以大大减轻土壤退化，改善土壤微生物活性，并重新组装一个具有更多病原抑制因子的非病原体独特微生物群，因此在单一栽培系统中防治土传病害可能是一种很有前途的消毒实践。